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CIENCIA. La vida secreta de las células, como nunca antes se había visto

 

La tomografía crioelectrónica y las técnicas relacionadas pueden mostrar el interior de las células con sorprendente detalle. Fuente: S. Albert et al ./ PNAS ( CC BY 4.0 )

Durante unas semanas en 2017, Wanda Kukulski, bioquímico de la Universidad de Berna, Suiza, se encontró viendo un tipo de película inusual: videos del interior de las células. Fueron hechos usando una técnica llamada tomografía crioelectrónica (crio-ET) que permite a los investigadores ver las proteínas en las células en alta resolución. En estos videos, pudo ver todo tipo de cosas sorprendentes, como el funcionamiento interno de las celdas y los compartimentos dentro de ellas, con un detalle sin precedentes. 

En los últimos años, las técnicas de obtención de imágenes como la crio-ET han comenzado a permitir a los científicos ver moléculas biológicas en sus entornos nativosA diferencia de los métodos más antiguos que sacan proteínas individuales de sus nichos para estudiarlas, estas técnicas brindan una visión holística de las proteínas y otras moléculas junto con el paisaje celular. Aunque todavía tienen limitaciones, las técnicas están aumentando en popularidad y sofisticación. 

Los investigadores que recurren a ellos no solo quedan hipnotizados por las hermosas imágenes, sino que también quedan impresionados por algunos de los secretos que se están revelando, como los trucos que usan las bacterias para infectar células o cómo las proteínas mutadas impulsan enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson. Cada mirada a través del microscopio es otra oportunidad de explorar un terreno celular inexplorado.

De los cristales al contexto

Durante décadas, los investigadores se han basado en una técnica llamada cristalografía de rayos X para visualizar proteínas, virus y otras entidades biológicas. El método implica persuadir a las moléculas para que formen cristales estáticos y bien ordenados y luego bombardear las muestras con intensos rayos X. Permitió descubrir la naturaleza helicoidal del ADN y la estructura de más de 100.000 proteínas, pero tiene sus limitaciones: cristalizar moléculas es difícil y tedioso, y no siempre es posible.

Los científicos han superado estos inconvenientes utilizando microscopía crioelectrónica (crio-EM), una técnica que revela la estructura de biomoléculas que han sido aisladas de su entorno y luego congeladas. En crio-EM, las muestras se bañan con haces de electrones. Aunque la técnica fue inicialmente ridiculizada como 'blobología', debido a las imágenes borrosas que producía, los avances en la preparación de muestras y el procesamiento de imágenes han aumentado su resolución lo suficiente como para visualizar átomos individuales (alrededor de 1.2 ångströms o 1.2 × 10 –10 m de tamaño).

A medida que esta 'revolución de la resolución' comenzó a arrasar con la crio-EM, alrededor de 2013, los científicos acudieron en masa al método. Hasta ahora, los investigadores lo han utilizado para resolver las estructuras de más de 10.000 moléculas biológicas. Las proteínas que se encuentran en las membranas celulares, en particular, han sido de interés, porque muchas de ellas son importantes para comprender las enfermedades y desarrollar fármacos. 

Sus primeros defensores buscaron una técnica que pudiera ver las moléculas biológicas no solo con gran detalle, sino también como mirarían dentro de las células. Al igual que cryo-EM, cryo-ET requiere un microscopio electrónico y se basa en un método de preparación de muestras conocido como vitrificación: el enfriamiento rápido del agua alrededor de una muestra para que se congele en un estado similar al vidrio, en lugar de como cristales de hielo. Sin embargo, a diferencia de la crio-EM convencional, que requiere muestras purificadas, los investigadores pueden utilizar la crio-ET para capturar estas moléculas in situ.

Un corte a través de un tomograma celular que contiene una pila de Golgi representativa y la segmentación 3D correspondiente

Una célula de algas revela sus secretos bajo crio-ET, mostrando el retículo endoplásmico (amarillo), que produce proteínas, las bolsas del aparato de Golgi (verde y magenta), que modifica y empaqueta proteínas para el transporte, y vesículas (círculos pequeños, varios colores), que transportan proteínas. Fuente: YS Bykkov et al ./ eLIFE ( CC BY 4.0 )

Con cryo-EM, los científicos crean una imagen en 3D tomando fotografías en 2D de muchas moléculas aisladas en diferentes configuraciones y fusionando los resultados. Con cryo-ET, por el contrario, toman múltiples instantáneas de un solo trozo de material, repleto de moléculas, desde muchos ángulos diferentes, lo que permite que el entorno se mantenga intacto. 

Es como tener una foto de toda una multitud, en lugar de la foto de una persona en la cabeza. Por eso, los científicos la han denominado “sociología molecular”. Y así es como viven las proteínas, después de todo. “Las proteínas son sociales: en un momento dado, una proteína está en un complejo con unas diez proteínas más”.

La tomografía electrónica en sí, el uso de un microscopio electrónico para obtener imágenes de una muestra desde varios ángulos, ha existido desde la década de 1960, pero no fue hasta la década de 1990 que el método comenzó a cobrar sentido. Uno de los desafíos fue que las corrientes de electrones son extremadamente dañinas para las muestras biológicas, lo que dificulta la captura de suficientes instantáneas para obtener una imagen clara y nítida. Los científicos han mejorado sus imágenes utilizando los últimos procesos de corte de muestras y métodos computacionales. Por ejemplo, una técnica llamada fresado con haz de iones enfocado en crio (crio-FIB) puede cortar muestras en rebanadas extremadamente delgadas conocidas como laminillas. Aún así, el coste y la experiencia técnica necesarios para usar crio-ET, particularmente en combinación con métodos como el fresado crio-FIB, pueden ser prohibitivos para muchos laboratorios.

Las primeras demostraciones de crio-ET incluyeron instantáneas 1 de las células de Dictyostelium , una ameba devoradora de bacterias que vive en el suelo. El equipo investigador reveló, entre otras cosas, características nunca antes vistas de las intrincadas redes de proteínas que forman el citoesqueleto de la ameba, como la forma en que los filamentos individuales interactúan entre sí y se adhieren a estructuras específicas en las membranas de las células de Dictyostelium .

Células sociables

Gran parte del trabajo inicial con crio-ET se realizó en procariotas: organismos unicelulares como las bacterias. Estas células suelen ser más pequeñas y delgadas que las células más complejas de los eucariotas.

En un estudio de Jensen de 2006, por ejemplo, él y su equipo informaron sobre la primera estructura completa del motor que impulsa el flagelo, un apéndice en forma de látigo en la bacteria 2 . Usando cryo-ET, revelaron la arquitectura del motor de 20 piezas en Treponema primitia , una bacteria que se encuentra en los intestinos de las termitas, y detallaron cómo se colocaron estas partes en la membrana bacteriana. Jensen y sus colegas también han revelado detalles clave de pili bacterianos, protuberancias que los microorganismos usan para muchas funciones, como adherirse y secretar sustancias en las células que infectan. El año pasado, su equipo publicó un atlas digital de acceso abierto (consultar go.nature.com/3nugs7v ) en el que se destacan las muchas ideas que ha revelado cryo-ET sobre las células bacterianas y otras células procariotas.

Más recientemente, los científicos han pasado a obtener imágenes de células eucariotas, que son palaciegas en comparación con las procariotas. Esto ha sido posible en gran parte debido a la llegada del fresado crio-FIB, que permite a los investigadores cortar las células en rodajas finas antes de colocarlas bajo un microscopio electrónico. Esta combinación de métodos ha permitido visualizar cómo se organizaron las moléculas en la vecindad del núcleo en una célula humana 3 . El trabajo investigador reveló cómo filamentos nanométricos delgados, nunca antes vistos, proporcionaban soporte estructural al núcleo, convirtiéndolo en uno de los orgánulos más rígidos de las células animales.

Primicia interior.  El gráfico muestra una vista anotada de una imagen de tomografía crioelectrónica.

Fuente: Ref. 3

Incluso con la molienda de FIB, cryo-ET puede capturar solo pequeños segmentos de células eucariotas, lo que significa que los científicos deben encontrar una manera de identificar moléculas de interés en un paisaje celular vasto y abarrotado. Una solución es seleccionar proteínas etiquetándolas primero con fluorescencia bajo un microscopio óptico y luego ampliando los detalles más finos en secciones específicas usando cryo-ET.

Los científicos han utilizado esta combinación de técnicas para resolver la arquitectura de LRRK2, una proteína vinculada a formas hereditarias de la enfermedad de Parkinson 4 . Su trabajo reveló que la versión mutada de la proteína se adhirió a componentes del citoesqueleto conocidos como microtúbulos, formando una doble hélice a su alrededor. Los hallazgos del equipo también insinuaron que el LRRK2 mutado podría formar una configuración que promueva este tipo de unión, lo que podría causar problemas al bloquear moléculas que transportan una carga celular importante a lo largo de los microtúbulos 5 .

Otros grupos de investigación han utilizado este método para examinar cómo las proteínas asociadas con enfermedades neurogenerativas como Huntington 6 y la enfermedad de la motoneurona (esclerosis lateral amiotrófica o ELA) 7 interactúan con componentes de la célula como el retículo endoplásmico (RE), un gran pieza de maquinaria celular que ayuda a sintetizar proteínas. Los investigadores han descubierto que los grupos neurotóxicos de proteínas implicadas en estas enfermedades se comportan de manera muy diferente entre sí dentro de las células. En Huntington, por ejemplo, los agregados de una forma mutante de una proteína llamada huntingtina parecen desorganizar la organización del RE, mientras que en la ELA, los agregados de una proteína anormal deterioran la bioquímica de la célula al activar su maquinaria de degradación de proteínas.

En el futuro, los científicos esperan utilizar estos métodos para comprender mejor cómo funciona la terapéutica, visualizando cómo actúan los fármacos en las entrañas moleculares de las células. En una demostración temprana, Julia Mahamid del Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania, y sus colegas pudieron vislumbrar antibióticos en una célula bacteriana que se une a los ribosomas, orgánulos que sirven como fábricas de proteínas 8 . La hazaña fue posible al impulsar la resolución de cryo-ET a 3,5 ångströms.

Combinaciones poderosas

Cryo-ET es un campo de rápido crecimiento, pero la técnica todavía tiene una serie de limitaciones. La resolución sigue siendo un problema. Aunque el nivel de detalle ha mejorado drásticamente en los últimos años, cryo-ET no puede alcanzar la resolución a nivel atómico de cryo-EM. 

En el nivel actual de rendimiento, es difícil identificar correctamente las moléculas en una célula usando cryo-ET. Entonces, a menos que los científicos estén mirando estructuras que previamente han sido bien caracterizadas, como el ribosoma, sus hipótesis sobre lo que ven con la técnica podrían resultar incorrectas. 

Imagen de una célula de dos formas diferentes: superresolución 3D criogénica correlativa y FIB-SEM 3D de células enteras congeladas vítreamente

Células enteras cortadas en rodajas muy finas y obtenidas con microscopía de superresolución. Crédito: Janelia Research Campus HHMI

Para eludir el problema de la resolución, algunos científicos han optado por intentar superar los límites de la crio-EM convencional mediante un método llamado cryoID 9 , que fusiona cryo-EM con varias otras técnicas. Uno de ellos implica romper las células abiertas en un método que permite que las proteínas permanezcan parcialmente dentro del medio celular original; de esta manera, los investigadores pueden ver las proteínas en un estado casi nativo. A pesar del enfoque actual más empleado en cryo-EM, todo parece indicar que cryo-ET es el futuro. 

Otra limitación de cryo-ET es su muestreo estrechoEl secreto mejor guardado de la tomografía es que cuando miras una célula de mamífero, un tomógrafo es menos del 0,1% de esa célula. Esto significa que los orgánulos grandes, como el núcleo, solo se pueden ver en pequeños segmentos. Para llenar este vacío, científicos como Harald Hess, un biofísico del campus de investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn, Virginia, están utilizando técnicas distintas de la crio-ET, a saber, microscopía de fluorescencia de súper resolución y microscopía electrónica, para visualizar células enteras. Usando estos métodos, Hess y sus colegas están obteniendo una nueva visión de cómo interactúan varios componentes celulares 10En un estudio publicado a principios de este mes, los investigadores demostraron que al utilizar el aprendizaje automático, una forma de inteligencia artificial, para ayudar a identificar estos componentes en muchas muestras, podían mapear la organización de hasta 35 tipos de orgánulos 11 .

Otros investigadores están combinando crio-ET con otra técnica llamada tomografía de rayos X que puede capturar imágenes de células completas. Esto permite a los científicos examinar la estructura de componentes más grandes, como mitocondrias o núcleos, y luego ampliar áreas específicas de interés.

Sin embargo, reunir estos métodos requiere dinero y habilidad. Además de eso, ambas técnicas bombardean muestras con radiación dañina. Eso hace que sea un desafío transferir una muestra entre ellos, dice Eva Pereiro, científica de línea de luz en la instalación del sincrotrón ALBA en Barcelona, ​​España, que produce rayos X adecuados para tomografía.

Algunos laboratorios ya han logrado esta hazaña. Maria Harkiolaki, científica principal de líneas de luz en Diamond Light Source, una instalación de sincrotrón en Didcot, Reino Unido, y sus colegas publicaron recientemente 12 un modelo de la mecánica de la infección por SARS-CoV-2 que utiliza crioET y tomografía de rayos X para dilucidar el proceso. Capturaron eventos tanto a nivel celular como de moléculas individuales, y propusieron una idea de cómo se replica el virus en las células de los primates.

Al igual que la crio-EM, la crio-ET eventualmente permitirá a los científicos ver las moléculas biológicas en detalle atómico. Hasta entonces, los científicos continúan investigando con entusiasmo qué conocimientos sobre la célula podrían ser revelados por cryo-ET y otros métodos similares. Debido a que estas herramientas pueden revelar estructuras que nunca antes se habían visto, los investigadores a menudo se quedan con nuevos misterios por resolver.

Fuentes:

1. Medalia, O. et al. Science 298 , 1209-1213 (2002).

2. Murphy, G. E., Leadbetter, J. R. & Jensen, G. J. Nature 442, 1062–1064 (2006).

3. Mahamid, J. et al. Science 351, 969–972 (2016).

4. Watanabe, R. et al. Cell 182, 1508–1518 (2020).

5. Deniston, C. K. et al. Nature 588, 344–349 (2020).

6. Bäuerlein, F. J. B. et al. Cell 171, 179–187 (2017).

7. Guo, Q. et al. Cell 172, 696–705 (2018).

8. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P. & Mahamid, J. Nature Methods 18, 186–193 (2021).

9. Ho, C.-M. et al. Nature Methods 17, 79–85 (2020).

10. Hoffman, D. P. et al. Science 367, eaaz5357 (2020).

11. Heinrich, L. et al. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-021-03977-3 (2021).

12. Mendonça, L. et al. Nature Commun. 12, 4629 (2021).

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