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En qué consiste la técnica de edición genética CRISPR


La genetista Jennifer Doudna ha coinventado una nueva tecnología revolucionaria para editar los genes, llamada CRISPR-Cas9. La herramienta permite a los científicos realizar ediciones precisas de las hebras de ADN, lo que podría conducir a tratamientos para enfermedades genéticas; pero también se podría utilizar para crear los llamados "bebés de diseño." 

Las bacterias tienen que lidiar con los virus en su entorno, y podemos pensar en una infección viral como una bomba de relojería, una bacteria tiene solo unos minutos para desactivar la bomba antes de que sea destruida. 

Muchas bacterias tienen en sus células un sistema inmune adaptativo llamado CRISPR, que les permite detectar el ADN viral y destruirlo.

La edición del genoma (también llamada edición de genes) es un grupo de tecnologías que les da a los científicos la capacidad de cambiar el ADN de un organismo. Estas tecnologías permiten agregar, eliminar o alterar el material genético en lugares específicos del genoma. 
La tecnología CRISPR es como software para el genoma, se puede programar fácilmente, usando estos pequeños trozos de ARN.
Se han desarrollado varios enfoques para la edición del genoma. Una reciente se conoce como CRISPR-Cas9, que es la abreviatura de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente e interespaciadas, y la  proteína 9 asociada a CRISPR. El sistema CRISPR-Cas9 ha generado mucha emoción en la comunidad científica porque es más rápido, más barato, más preciso y más eficiente que otros métodos de edición de genoma existentes.
La razón para imaginar el uso del sistema CRISPR para la ingeniería del genoma es porque las células tienen la capacidad de detectar el ADN roto y repararlo.
CRISPR-Cas9 fue adaptado de un sistema de edición de genoma natural en bacterias. Las bacterias capturan fragmentos de ADN de virus invasores y los utilizan para crear segmentos de ADN conocidos como matrices CRISPR. Las matrices CRISPR permiten que las bacterias "recuerden" los virus (o los estrechamente relacionados). Si los virus atacan de nuevo, la bacteria produce segmentos de ARN a partir de las matrices CRISPR para atacar el ADN de los virus. Las bacterias luego usan Cas9 o una enzima similar para separar el ADN, lo que desactiva el virus.

En la fase de adquisición, el ADN extraño se incorpora al genoma bacteriano en los loci CRISPR. Los loci CRISPR se transcriben y procesan en crRNA durante la biogénesis de crRNA. Durante la interferencia, la endonucleasa Cas9 complejada con un crRNA y un tracrRNA separado escinde el DNA extraño que contiene una secuencia complementaria de crRNA de 20 nucleótidos adyacente a la secuencia PAM. (Figura no dibujada a escala)

El sistema CRISPR-Cas9 funciona de manera similar en el laboratorio. Los investigadores crean una pequeña porción de ARN con una secuencia "guía" corta que se une a una secuencia diana específica de ADN en un genoma. El ARN también se une a la enzima Cas9. Como en las bacterias, el ARN modificado se usa para reconocer la secuencia de ADN, y la enzima Cas9 corta el ADN en la ubicación seleccionada. 
Cuando los virus infectan una célula, inyectan su ADN. Y en una bacteria, el sistema de CRISPR permite que el ADN se extraiga del virus, y se inserte en pequeños trozos en el cromosoma, del ADN de la bacteria. Y estos trozos integrados de ADN viral se insertan en un sitio llamado CRISPR. 
Aunque Cas9 es la enzima que se usa con mayor frecuencia, también se pueden usar otras enzimas (por ejemplo, Cpf1). Una vez que se corta el ADN, los investigadores utilizan la maquinaria de reparación de ADN de la propia célula para agregar o eliminar fragmentos de material genético, o para realizar cambios en el ADN al reemplazar un segmento existente con una secuencia de ADN personalizada.
 Científicos chinos mostraron recientemente que incluso podrían usar la tecnología CRISPR para cambiar genes en embriones humanos. Y científicos en Filadelfia mostraron que podían usar CRISPR para eliminar el ADN de un virus VIH integrado a partir de células humanas infectadas.
La edición del genoma es de gran interés en la prevención y el tratamiento de enfermedades humanas. Actualmente, la mayoría de las investigaciones sobre la edición del genoma se realizan para comprender las enfermedades que utilizan células y modelos animales. Los científicos todavía están trabajando para determinar si este enfoque es seguro y eficaz para su uso en las personas. Se está explorando en la investigación sobre una amplia variedad de enfermedades, incluidos trastornos de un solo gen como la fibrosis quística , la hemofilia y la enfermedad de células falciformes. También es prometedor para el tratamiento y la prevención de enfermedades más complejas , como el cáncer, las enfermedades cardíacas, las enfermedades mentales y la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Pero hay que considerar también que la tecnología CRISPR se puede usar para mejoras. Imaginemos que se intentara diseñar humanos con propiedades mejoradas, como huesos más fuertes, o menos susceptibilidad a enfermedades cardiovasculares o incluso con propiedades que consideramos quizá deseables, como un color de ojos diferentes o ser más altos y cosas así. "Humanos de diseño", si se quiere. En este momento, la información genética para entender qué tipos de genes dan lugar a estos rasgos en su mayoría no se conocen. Pero es importante saber que CRISPR es una herramienta para hacer este tipo de cambios, una vez que el conocimiento esté disponible.
Las preocupaciones éticas surgen cuando la edición del genoma, usando tecnologías como CRISPR-Cas9, se usa para alterar los genomas humanos. La mayoría de los cambios introducidos con la edición del genoma se limitan a las células somáticas, que son células que no son óvulos ni espermatozoides. Estos cambios afectan solo ciertos tejidos y no se transmiten de una generación a otra. 

Sin embargo, los cambios realizados a los genes en óvulos o células de esperma (células germinales) o en los genes de un embrión podrían transmitirse a las generaciones futuras. La edición del genoma de células germinales y embriones plantea una serie de desafíos éticos, incluido si sería permisible utilizar esta tecnología para mejorar los rasgos humanos normales (como la altura o la inteligencia). En base a las preocupaciones sobre ética y seguridad, la edición de células germinales y del genoma embrionario actualmente es ilegal en muchos países.


A. El sitio de nucleasa Cas9 de tipo salvaje escinde específicamente la maquinaria de reparación de ruptura de doble cadena activadora de ADN de doble cadena. En ausencia de una plantilla de reparación homóloga, la unión del extremo no homólogo puede dar como resultado indentificaciones que alteren la secuencia diana. Alternativamente, pueden realizarse mutaciones y knock-ins precisas proporcionando una plantilla de reparación homóloga y explotando la vía de reparación dirigida por homología. 
B. Cas9 mutado hace un nick específico de una sola línea de sitio. Se pueden usar dos sgRNA para introducir una ruptura de doble cadena escalonada que luego puede someterse a reparación dirigida por homología. 
C. Cas9 deficiente en nucleasa puede fusionarse con varios dominios permitiendo la localización específica. Por ejemplo, activadores transcripcionales, represores y proteínas fluorescentes

Aplicaciones como herramienta de edición genética
Tras su demostración inicial en 2012, el sistema CRISPR / Cas9 ha sido ampliamente adoptado. Esto ya se ha usado con éxito para identificar genes importantes en muchas líneas celulares y organismos, incluidos humanos, bacterias, pez cebra, plantas, Xenopus tropicalis , levadura, Drosophila, monos, conejos, cerdos, ratas y ratones. Varios grupos ahora han aprovechado este método para introducir mutaciones de punto único en un gen diana particular, a través de un solo gRNA. Usando un par de nucleasas Cas9 dirigidas por gRNA en su lugar, también es posible inducir grandes deleciones o reordenamientos genómicos, tales como inversiones o translocaciones. Un desarrollo reciente y emocionante es el uso de la versión dCas9 del sistema CRISPR / Cas9 para identificar dominios proteicos para la regulación transcripcional, la modificación epigenética y la visualización microscópica de loci del genoma específico.

El sistema CRISPR / Cas9 solo requiere el rediseño del crRNA para cambiar la especificidad del objetivo. Esto contrasta con otras herramientas de edición del genoma, como el dedo de zinc y TALEN, donde se requiere el rediseño de la interfaz proteína-ADN. Además, CRISPR / Cas9 permite un rápido examen genómico de la función del gen mediante la generación de grandes bibliotecas de gRNA para el cribado genómico.

El futuro de CRISPR / Cas9
El rápido progreso en el desarrollo de Cas9 en un conjunto de herramientas para la investigación de biología celular y celular ha sido notable, probablemente debido a la simplicidad, alta eficiencia y versatilidad del sistema. De los sistemas de nucleasa de diseñador actualmente disponibles para la ingeniería de genoma de precisión, el sistema CRISPR / Cas es de lejos el más fácil de usar. Ahora también está claro que el potencial de Cas9 va más allá de la escisión del ADN, y su utilidad para el reclutamiento específico de proteínas del locus del genoma probablemente solo estará limitado por nuestra imaginación.

Así, los humanos de ingeniería genética aún no están con nosotros, pero esto ya no es ciencia ficción. Animales y plantas de ingeniería genética están sucediendo en este momento. Y esto nos enfrenta a todos con una gran responsabilidad, de considerar prudentemente tanto las consecuencias no deseadas como los impactos previstos (o imprevistos) de un avance científico.

Fuentes:
Gupta RM, Musunuru K. Ampliación del kit de herramientas de edición genética: ZFN, TALEN y CRISPR-Cas9. J Clin Invest. 2014 Oct; 124 (10): 4154-61. doi: 10.1172 / JCI72992. Epub 2014 1 de octubre. Revisión. PubMed: 25271723 . Texto completo disponible de PubMed Central: PMC4191047 .

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